光交聯技術的生物應用研究進展

摘要：光交聯反應作為一種快速、簡單和時空可控的交聯工具廣泛地應用于化學、生物、醫學和材料等不同研究領域。本文詳細介紹了常用的小分子光交聯基團的結構、分類及反應機理，重點綜述了光交聯技術在生物醫學領域的應用研究，并對其應用前景進行了展望。目前大多光交聯基團僅對紫外和可見光具有敏感性，紫外和可見光穿透力弱、組織吸收強和散射等問題嚴重限制了該技術在生物體內的應用研究。因此，進一步研究光交聯技術在生物體系的應用和開發長波長光（如近紅外或遠紅外光）介導的新交聯技術對于藥物研發和疾病診療具有重要的科學意義。

引 言

光化學反應又稱光化作用，一般是指物質在可見光或紫外線照射下，物質分子吸收光子后所引發的化學反應。目前能激活物質分子的光源種類繁多，如紅外光、可見光、紫外光、激光等。紫外光一般對光化學反應為有效；紅外光由于能量低，只能引起分子化學鍵的振動擾動，很難引發化學反應的發生；而可見光常常被用作光化學反應的引發劑，通常是以光敏劑作為媒介，間接地將光能轉移到一些可見光不敏感的反應中去，進而引起光化學反應的發生。總之，光介導的化學反應具有操作簡單、反應速度快、副產物少等優點，符合綠色化學的要求，受到光化學研究者們的廣泛青睞。上海峰志儀器有限公司提供253nm、302nm、365nm、395nm紫外交聯儀以及450nm、530nm、660nm可見光交聯儀。

光交聯是光化學反應中目前應用為廣泛的一種反應。光交聯反應（也稱作光親和標記，photoaffinitylabeling,pal）是指將合成的光敏小分子化合物作為工具探針，在特定波長的光照射下，產生高活性的中間體，與其受體活性部位形成特異性的不可逆共價鍵結合的化學反應。早在1962年，westheimer等人首先提出光親和標記技術，至今該技術已取得令人矚目的發展。由于光交聯反應具有速度快、條件簡單、適合于原位反應等優點，早主要應用于蛋白質的化學修飾和藥物靶標蛋白甄別。之后，光交聯反應逐漸被應用于研究蛋白與小分子、生物大分子、蛋白或受體間的相互作用。目前該技術已經成為生物化學家和分子生物學家研究生物體系中空間相鄰組分及生物大分子間相互作用的一個重要工具。近年來，隨著光學技術與生物醫學的不斷發展，光交聯技術被廣泛地應用于化學、生物、材料和醫學等領域。

２ 光交聯反應基團及其作用機制

常見的光交聯基團根據其在光照射下生成活性中間體的不同，大致分為四類：氮賓（nitrenes）類、卡賓（carbenes）類、碳正離子（carbocations）和自由基（radicals）類（如圖 １）。目前應用為廣泛的光交聯基團有苯甲酮、疊氮苯和3三氟甲基3苯基二吖丙啶（３ trifluoromethyl 3 phenyldiaz irine TFMD）。通常理想的光交聯基團應具備以下幾個特征：（１）具有一定的化學穩定性，耐受普通的化學反應；（２）在自然光中具有合理的穩定性；（３）黑 暗 中 穩 定，在 不 對 樣 品 造 成 損 傷（＞３００ｎｍ）的紫外光照下很容易光解；（４）光解后的活性中間體既能與親核的 XH（Ｘ＝Ｎ，Ｓ，Ｏ）官能團反應，也能與 ＣＨ官能團反應；（５）光解中間體與受體作用得到的產物應該比較穩定，能夠耐受分離、純化和分析等操作.

２．１ 氮賓（nitrnenes）類

芳香疊氮化合物是常見的產生氮賓（nitrnenes）類前體的化合物，也是較常用的光交聯基團。它的光化學反應機理為：分子在外來光照射

下，芳環上的疊氮基團會首先形成單線激發態，然后釋放出氮氣生成氮賓。氮賓可以是單線態的中間體，也可以經系間竄越形成三線態中間體。單線態氮賓可以對CH鍵或者XH鍵（Ｘ ＝Ｏ，Ｎ，Ｓ）進行插入反應形成共價鍵結合的產物，也可以重排為 １氮雜２４６環庚四烯（didehydrozaepine）或者通過系間竄越形成三線態中間體。三線態中間體以自由基形式吸收質子氫生成氨基化合物或形成偶聯產物。因此，單線態氮賓具有親電子活性，是發揮交聯作用的主要形式。但是，單線態氮賓只能夠穩定存在約100us，隨后將迅速重排生成比較穩定的烯亞胺，這種烯亞胺分子的反應活性較弱，只能與親核性官能團反應（如 ＯＨ、ＮＨ、ＳＨ等）。如果活性位點部分沒有親核性官能團，那就可能遷移到離活性位點較遠區域交聯，產生非特異性交聯。

２．２ 卡賓（carbenees）類

卡賓類分為重氮化合物和雙吖丙啶類化合物。重氮化合物與疊氮化合物類似，在紫外光的照射下，重氮基團釋放一個 Ｎ２分子，形成卡賓中間體，隨后進攻鄰近的 Ｃ－Ｈ鍵，生成一個新的共價鍵。該卡賓中間體也會進行 Ｗｏｌｆｆ重排，形成烯酮，烯酮再與親核試劑反應，產生非特異性交聯。雙吖丙啶基團在黑暗中具有良好的穩定性，同時具有較好的光交聯活性。其反應機理：在３５０ｎｍ或 ３６５ｎｍ紫外光的照射下，雙吖丙啶基團首先發生共價鍵斷裂，釋放出一分子 Ｎ２，隨后鍵電子重排，形成活性的卡賓中間體，插入到鄰近的 Ｃ－Ｈ鍵或者其他雜原子與 Ｈ的共價鍵中，生成新的共價鍵。這里形成的卡賓中間體半衰期一般在 ｎｓ級，交聯反應非常迅速。

２．３ 碳正離子（carbocations）

除了氮賓類和卡賓類基團外，碳正離子也是具有高活性的光交聯基團［１６］。芳香重氮鹽化合物就是常用的碳正離子前體。首先，芳香重氮鹽化合物在紫外光照射下，釋放 Ｎ２形成高活性的芳香正離子中間體，隨后插入到鄰近的 ＣＨ鍵或者其他雜原子與 Ｈ的共價鍵中，形成新的共價鍵。由于芳香重氮鹽化合物上重氮的吸電子性使其在通常條件下非常不穩定，一些研究中通過在芳香環上引入供電子基團來改善化合物的穩定性［１７］。

２．４ 自由基（radicals）類

自由基是光交聯反應中另一類非常重要的高活性中間體。苯甲酮類化合物是生成自由基的一類常用的、高效的光交聯反應化合物。在紫外光的照射下，苯甲酮基團能夠產生活性三線態雙自由基，自由基分子不發生重排反應，會與周圍的CH鍵發生反應。如果其周圍沒有適當的CH鍵存在，雙自由基能夠穩定存在１２０μｓ，后回復到初始狀態，等待再次被激活［１８］。此外，苯甲酮產生的活性三線態雙自由基在質子性溶劑中穩，幾乎不與水反應，其標記效率較高，對于光交聯標記實驗非常有用.

４ 結束語

光交聯技術由于其簡便、快捷、高效和時空可控等優勢目前被廣泛地應用于藥物篩選、靶標蛋白甄別和生物大分子間作用等研究。隨著納米材料和技術的飛速發展，光交聯技術近年來從分子生物學領域逐漸拓展到了納米材料和醫學等領域。然而，由于目前光交聯反應源主要以紫外光為主，其穿透力淺，組織損害等問題一定程度上限制了該技術在生物醫學領域的深入應用。如何克服前述問題，使用近紅外或遠紅外觸發交聯反應將是一種新的思路，但由于目前對近紅外或遠紅外光敏感的化學交聯反應報道較少，發掘該類化學反應對于合成化學家將是一大挑戰。總之，相信不久的將來光交聯技術一定會在化學、生物、材料和醫學等各個領域有著更為廣泛的應用前景。

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