熒光顯微鏡工作原理

多采用200W的超高壓汞燈作光源，它是用石英玻璃制作，中間呈球形，內充一定數量的汞，工作時由兩個電極間放電，引起水銀蒸發，球內氣壓迅速升高，當水銀完全蒸發時，可達50～70個標準大氣壓力，這一過程一般約需5～15min。超高壓汞燈的發光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發射光量子的結果。它發射很強的紫外和藍紫光，足以激發各類熒光物質，因此，為熒光顯微鏡普遍采用。

1．激發濾板根據光源和熒光色素的特點，可選用以下三類激發濾板，提供一定波長范圍的激發光。
紫外光激發濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過，阻擋400nm以上的可見光通過。常用型號為UG-1或UG-5，外加一塊BG-38，以除去紅色尾波。
紫外藍光激發濾板：此濾板可使300～450nm范圍內的光通過。常用型號為ZB-2或ZB-3，外加BG-38。
紫藍光激發濾板：它可使350～490nm的光通過。常用型號為QB24（BG12）。
zui大吸收峰在500nm以上者的熒光素（如羅達明色素）可用藍綠濾板（如B-7）激發。

熒光顯微鏡和普通顯微鏡的區別

熒光顯微鏡是利用紫外線為光源，用以照射被檢驗的物體，使該物體發出光源，然后在顯微鏡下進行對物體的觀察。主要是用于免疫熒光細胞，主要是由光源、濾板系統和光學系統組成的在通過目鏡和物鏡的放大來觀察樣本的熒光圖像。我們來看下這熒光顯微鏡和普通光學顯微鏡有什么樣的區別。
1、在照明方式上看
熒光顯微鏡的照明方式一般是用落射式，也就是說光源是通過物鏡來投放于試驗樣本上。

2、在分辨率上看
熒光顯微鏡利用的是紫外線做為光源，波長比較短，但是分辨率卻高于普通的光學顯微鏡。
3、在濾光片上的不同
熒光顯微鏡是用了兩個特殊的濾光片，在光源前用是用來濾出可見光，在物鏡和目鏡之間的使用來濾出紫外線，這樣可以保護人的眼睛。
熒光顯微鏡也屬于光學顯微鏡的一種，主要是銀光顯微鏡所激發的波長短，所以這才導致了熒光顯微鏡和普通顯微鏡雜結構構造和使用上的不同，熒光顯微鏡大都有良好的捕捉弱光的功能，所以在極其微弱的熒光下，它的成像能力也和好。再加上近年來對熒光顯微鏡的不斷改善，噪音也大幅度降低。因此越來越多的熒光顯微鏡得到應用。
以上是關于熒光顯微鏡和普通光學顯微鏡的區別，了解這些以后，在鑒別是不是熒光顯微鏡會有很大的幫助。

熒光顯微鏡與普通光學顯微鏡區別及特性
熒光顯微鏡與普通光學顯微鏡不同，它不是通過普通光源的照明觀察標本，而是利用定波長的光(通常是紫外光、藍紫光)激發顯微鏡下標本內的熒光物質，使之發射熒光，所以，熒光顯微鏡的光源所起的作用不是直接照明，而是作為種激發標本的內熒光物質的能源。我們之所以能觀察標本，不是由于光源的照明，而是標本內熒光物質吸收激發的光能后所呈現的熒光現象。由此可知，熒光顯微鏡的特點，主要是它的光源能供給大量特定波長范圍的激發光，使受檢標本內的熒光物質能獲得必要強度的激發光。同時，熒光顯微鏡必須具備相應的濾光鏡系統。熒光顯微鏡是**熒光組織化學的基本工具。它是由超壓光源、濾片系統(包括激發和壓制濾板)、光學系統和攝影系統等主要部件組成，是利用定波長的光激發標本發射熒光。
1.激發熒光的方式：按光的波長范圍分為UV激發法(使用紫外線照明法)和BV激發法(使用藍紫光)兩種。UV激發法是用短于400nm的近紫外光進行激發。該法不存在可見的激發光，所以被觀察的熒光呈現該染料固有的熒光，容易判別標本上的特異熒光和背景組織的自身熒光。
2.BV激發法：是以404nm、434nm為中心的由紫外至藍光進行激發。該方法使用藍光照射標本，所以熒光觀察系統的截止濾光片必須使用可完全阻斷藍光并可充分通過所需綠、黃熒光的濾光片。用于熒光抗體法的熒光色素。對于激發光的大吸收波長和熒光的大發光波長比較接近，所以BV激發法使用的濾光片必須使用銳截止式濾光片。該法可用藍光作為激發光，所以熒光色素的吸收效率較，可得到較明亮的圖像。其缺點是500nm以下的熒光無法看到，而500nm以上的使整個圖像顯黃色。在熒光抗體法中，大多以熒光色素特有的顏色來判斷其特異性，所以在討論微妙的特異性時，上述BV激發法的缺點往往影響大。

熒光顯微鏡與普通光學顯微鏡光源的區別
熒光顯微鏡的光源主要采用氙弧燈或汞燈，但近年來也使用高功率LED作光源，而普通光學顯微鏡通常只有鹵素或LED燈來照明。熒光顯微鏡的照明方式一般是用落射式，也就是說光源是通過物鏡來投放于試驗樣本上，而普通光學顯微鏡是直接用光源照射樣品，從而進行的觀察。在分辨率上講，熒光顯微鏡利用的是紫外線光源，波長比較短，但是分辨率卻高于普通的光學顯微鏡。在濾光片的使用上，熒光顯微鏡是用了兩個特殊的濾光片，在光源前的作用是用來濾出可見光，在物鏡和目鏡之間的作用是用來濾出紫外線，以保護觀察者的眼睛。熒光顯微鏡與普通光學顯微鏡的區別大致就是這些。

熒光顯微鏡使用方法

1、用窗簾遮蔽光線，關閉房間內的電燈，除去熒光顯微鏡的防塵罩，確保熒光顯微鏡燈室通風良好、無遮蓋。裝上汞燈燈箱，并轉動燈箱卡圈上的撥桿，將燈箱與鏡臂連接。
2、將汞燈燈箱的電源插頭插入熒光電源箱后的插座，再將熒光電源箱的插頭插入220V外接電源。
3、打開熒光顯微鏡電源開關，電壓表顯示出電源電壓，如電源電壓波動不大于額定電壓值的5%，即可按下啟動開關點燃汞燈，如因天氣太冷或電壓不穩定等原因，一次啟動未點燃汞燈，可以多按幾次。待超高壓汞燈弧光達到穩定狀態并達到Zda發光效率，即可開始工作。
4、燈泡的使用調中：
①任選一塊標本放在熒光顯微鏡載物臺上。
 ②轉動鏡臂上的聚光鏡旋鈕使聚光鏡移出光路，轉動濾色片組轉換手輪，將紫光(V)或藍光(B)或綠光(G)激發濾色片組轉入光路，并將25熒光物鏡轉入光路。
③調節粗微調手輪，將標本像調焦清晰。
④前后推動垂直照明器右邊的聚光鏡調焦推桿，使視場光欄成像清晰，轉動視場光欄撥桿將視場光欄收小，調節視場光欄調中螺釘使視場光欄居中，然后再將視場光欄開至Zda。
⑤轉動鏡臂上的聚光鏡旋鈕使聚光鏡移入光路，前后調節燈箱上的聚光鏡撥桿，使汞燈的弧光在視場內成像清晰。
⑥調整燈箱上的燈泡水平調節螺釘和垂直調節螺釘，使汞燈的弧光居中。
⑦調整反光鏡水平調節螺釘和垂直調節螺釘，使光源的反射像與汞燈的弧光分開。
⑧轉動聚光鏡旋鈕把聚光鏡移出光路，此時視場照明均勻。
5、熒光顯微鏡使用過程中熒光觀察：
①將熒光染色標本放到熒光顯微鏡載物臺上。
②將10x平場物鏡或25x熒光物鏡轉入光路，調節載物臺縱橫移動手輪，將標本移入光路。
③轉動濾光片轉換撥輪，將熒光染色標本所需要的激發濾光片組轉入光路。激發濾光片組編號刻在濾片組轉換撥輪上。濾光片選擇正確與否，是熒光顯微鏡能否得到正確應用的關鍵。選用濾光片時，必須遵守斯托克斯定律：激發濾光片的透射波長<雙色束分離器的透射波長<阻斷濾光片的透射波長。
④調節粗調手輪，當看清熒光圖像輪廓后，再用微調手輪調焦，直至看到清晰的熒光圖像。
⑤當需要得到較強的熒光圖像時，可轉動聚光鏡旋鈕把聚光鏡移入光路，可獲得較明亮的熒光圖像。
⑥當需要使用40x或100x熒光物鏡觀察時，應在標本和物鏡間加上甘油，油中不能有影響觀察的小泡或雜質。使用時可使甘油慢慢浸潤一會兒，然后輕輕左右來回轉動物鏡轉換器以排除氣泡。

6、熒光顯微攝影
由于熒光圖像一般均較明場觀察暗得多，所以進行熒光顯微攝影需要較長的曝光時間，在曝光時應注意避免熒光顯微鏡震動。為了縮短曝光時間，可選擇倍率較低的攝影目鏡或感光度較高的攝影膠片如ASA200以上或DIN24以上。
熒光顯微鏡攝影技術對于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時攝影記錄結果。方法與普通顯微攝影技術基本相同。因紫外光對熒光猝滅作用大，如FITC的標記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動或全自動顯微攝影系統裝置。

7、熒光圖像的記錄方法
熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態學特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結果時，必須將二者結合起來綜合判斷。結果記錄根據主觀指標，即憑工作者目力觀察。作為一般定性觀察，基本上是可靠的。
8、熒光顯微鏡使用結束，關閉電源，做好鏡頭和載物臺的清潔工作，待燈室冷卻至室溫后，用防塵罩蓋好顯微鏡，并做好使用記錄。

熒光顯微鏡使用步驟

1.關閉房間內的電燈，開啟顯微鏡汞燈；
2.根據樣品標記的熒光素選擇相應的濾光片；
3.放好樣品，找到合適的視野；
4.如需拍照，請確認照相機內已裝好彩色膠卷（zui好使用27定膠卷）；
5.開啟自拍裝置，選擇手動檔，通常拍攝速度在0.5-10秒內；
6.使用結束，關閉電源并做好使用記錄。

熒光顯微鏡使用注意事項

1、嚴格按照熒光顯微鏡說明書要求進行操作，不要隨意改變程序。
2、熒光顯微鏡應在暗室中進行檢查。進入暗室后，接上電源，點燃超高壓汞燈5～15min，待光源發出強光穩定后，眼睛完全適應暗室，再開始觀察標本。
3、防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡。
4、檢查時間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發光強度逐漸下降，熒光減弱;標本受紫外線照射3～5min后，熒光也明顯減弱;所以，Z多不得超過2～3h。
5、熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再用時，須待燈泡充分冷卻后才能點燃。中應避免數次點燃光源。
6、標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發。
7、熒光亮度的判斷標準：一般分為四級，即“-”表示無或可見微弱熒光。“+”表示僅能見明確可見的熒光。“++”表示可見有明亮的熒光。“+++”表示可見耀眼的熒光。
8、其它注意事項、熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態學特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結果時，必須將二者結合起來綜合判斷。熒光顯微鏡攝影技術對于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時攝影記錄結果。